细胞死亡是维持机体正常生理功能的重要过程，也是肿瘤治疗领域的核心研究方向。从经典的细胞凋亡，到近年来备受关注的铜死亡（cuproptosis），科研人员持续挖掘细胞死亡背后的全新调控机制。然而，是否存在能够直接损伤肿瘤细胞DNA、且不依赖经典细胞死亡通路的分子机制？ 这一问题亟待探索。
铁氧还蛋白1（Ferredoxin 1，FDX1）是铜死亡通路中的关键蛋白，主要参与线粒体内铜代谢及相关生物学过程。过往研究大多聚焦于它在线粒体当中的功能，而其不同转录本及蛋白形式是否具有其他生物学作用，仍有待进一步研究。
近日，南开大学科研团队在Cell Death & Differentiation（Nature子刊）发表题为《FDX1‑short proteoform induces caspase‑independent cell death in tumor cells》的研究论文，揭示了FDX1的一种短蛋白形式——FDX1-SP。该蛋白缺失经典线粒体靶向序列，细胞内分布范围更广，能够在细胞核中发生富集，进而诱导DNA降解、核膜损伤和非经典细胞死亡。研究团队还进一步开发了FDX1-SP mRNA，并在患者来源异种移植（PDX）肿瘤模型中验证了其抗肿瘤潜力。
本研究实验过程中使用了赛索飞生物FISH探针合成服务，为转录本特异性识别与原位定位实验的开展提供了有力支撑。
捕捉核定位异象，发掘FDX1新功能
这项研究的灵感来源于临床肿瘤组织样本的观察结果。研究团队在肝细胞癌（HCC）和结直肠癌（CRC）临床样本中发现：FDX1的细胞核定位信号，和患者预后良好存在相关性。这一现象与FDX1传统的线粒体定位特征并不完全一致，暗示该蛋白或许存在独立于经典通路的生物学功能。
进一步分析发现，FDX1基因存在可产生短转录本的可变剪接形式。研究团队由此提出假设：缺失N端线粒体靶向序列的FDX1‑SP，会不会就是肿瘤细胞核内观察到FDX1信号的来源？
为验证这一假设，研究人员结合转录本特异性RNA荧光原位杂交（RNA FISH）、不同区域特异性抗体的免疫荧光分析、质谱、Western blot等多项实验手段，从RNA转录本到蛋白定位展开多维度交叉验证。
图1. 特异性RNA FISH：区分不同转录本，为机制解析提供依据。
本研究所使用的转录本特异性FISH探针，由赛索飞生物提供，并根据FDX1可变剪接转录本的特征序列定制合成。借助这套探针，研究人员可特异性识别不同FDX1转录本并结合后续蛋白水平实验，解析FDX1‑SP的胞内分布与潜在功能。
这一实验环节也凸显出转录本特异性检测的重要意义：当同一基因存在多个转录本时，仅检测总RNA表达水平，未必能够回答某个特定转录本是否存在、其定位有何特点等问题。针对目标转录本设计专属探针，能够为后续的机制研究提供更精准、直接的实验证据。
FDX1-SP进入细胞核，诱导新型细胞死亡
明确FDX1‑SP对应的转录本之后，研究团队进一步通过构建表达质粒，比较经典FDX1与FDX1-SP的细胞内定位及生物学效应。
实验结果显示，经典FDX1主要定位于线粒体，而FDX1-SP呈现更广泛的细胞内分布，并大量富集于细胞核。相较于经典FDX1，FDX1‑SP诱导肿瘤细胞死亡的效果更加显著，而且其表达水平与细胞死亡程度呈一定的剂量依赖关系。
研究人员进一步利用细胞死亡标志物检测结合抑制剂干预实验，探究该死亡过程是否依赖已知细胞死亡通路。结果发现，尽管部分相关标志物发生变化，但抑制凋亡、焦亡、坏死性凋亡及铜死亡等通路，并未显著阻断FDX1-SP诱导的细胞死亡。
图2. 琼脂糖凝胶电泳显示，FDX1-SP表达后肿瘤细胞DNA出现明显片段化，提示其诱导的细胞死亡伴随DNA降解。
这一发现将研究重点指向DNA本身：FDX1-SP是否不仅间接参与细胞死亡信号，甚至还可能直接影响DNA的完整性。
依托多维度实验，验证DNA降解活性
为解答上述疑问，研究团队使用纯化的FDX1-SP蛋白，搭建无细胞体外反应体系，分别检测该蛋白对单链DNA、线性双链DNA、环状双链DNA的作用效果。
体外实验证实，FDX1-SP能够降解不同形式的DNA，其降解活性整体强于经典FDX1。二价金属离子能够调控该降解过程，其中Mg²⁺能够增强FDX1-SP的DNA降解活性。
后续氨基酸定点突变实验发现，FDX1-SP部分酸性氨基酸残基发生突变后，其DNA降解能力明显下降。这些实验结果为FDX1-SP参与DNA损伤提供了生化证据。不过，研究人员也指出，FDX1-SP是否属于具有经典催化机制的核酸酶，还需要更多实验进一步验证。
图3. 体外DNA降解实验比较经典FDX1与FDX1-SP对线性双链DNA的作用，显示FDX1-SP具有更强的DNA降解活性。
在细胞层面，研究人员观察到FDX1-SP表达会导致DNA损伤标志物γH2AX信号增强、核膜完整性受损、细胞核形态异常。多项结果共同指向核心结论：FDX1-SP可直接造成DNA损伤，触发区别于经典凋亡途径的肿瘤细胞死亡程序。
立足新机制探索，评估体内抑瘤潜力
明确FDX1-SP的作用机制后，研究团队进一步探索其作为抗肿瘤治疗分子的可行性。科研人员制备了包封于脂质纳米颗粒（LNP）中的FDX1-SP mRNA，以期通过细胞内表达产生相应蛋白，发挥 DNA损伤杀伤肿瘤的作用。
团队首先进行了初步安全性评估，随后在肝细胞癌和结直肠癌的患者来源异种移植（PDX）小鼠模型中开展疗效研究。
动物实验结果显示，与对照组相比，FDX1-SP mRNA处理能够显著抑制两种PDX模型中的肿瘤生长，并降低肿瘤重量。组织学及免疫荧光检测显示，治疗后肿瘤组织出现更明显的DNA损伤和核膜破坏相关信号。实验期间，各组小鼠体重无明显差异，初步安全性评估也未发现明显的肝肾损伤或主要脏器组织病变。
图4. FDX1-SP mRNA治疗后，患者来源肿瘤异种移植模型中的肿瘤生长受到显著抑制，显示出进一步开展抗肿瘤研究的潜力。
需要注意的是，PDX动物模型上获得的积极结果仅属于临床前数据，后续还需要开展更系统的药效、安全性和作用机制研究，评估其临床转化可行性。
解析转录本差异，开辟肿瘤治疗思路
这项研究从肿瘤组织中异常的FDX1核定位现象出发，逐步揭示了FDX1短蛋白形式——FDX1-SP的生物学功能。研究团队通过结合转录本特异性RNA FISH、蛋白定位分析、体外DNA降解实验、体内动物模型验证，完整阐释全新作用通路：FDX1-SP在细胞核中积累并诱导DNA损伤，破坏核膜完整性，进而触发非经典细胞死亡。
值得一提的是，研究将基础机制延伸至治疗探索，在两种PDX肿瘤模型中证实FDX1‑SP mRNA 的抑瘤效果，为抗肿瘤新药开发提供全新实验思路。
从基础机制研究到潜在治疗应用，这项工作充分体现了转录本层面精准识别对功能研究的关键价值。对于存在可变剪接、不同转录本可能具有不同功能的基因，选择合适的检测策略，有助于研究人员更准确地解析其生物学作用。当科研探索从 “检测基因是否表达” 进阶到 “定位哪一种转录本发挥功能” 时，转录本特异性核酸探针，就成为连接分子序列差异与生物学表型的重要工具。
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