结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球高发恶性肿瘤之一，约85%的患者为微卫星稳定型（MSS），这类患者普遍存在新抗原稀缺、肿瘤浸润免疫细胞不足的问题，对免疫检查点抑制剂应答率极低。因此，如何改善肿瘤免疫微环境、增强免疫细胞对肿瘤的识别和清除，是当前结直肠癌研究的重要方向。近年来，肿瘤代谢与免疫微环境之间的相互作用成为研究热点，但代谢异常究竟如何影响NK细胞这一重要的先天免疫效应细胞，仍缺乏深入研究。
中山大学肿瘤防治中心研究团队在顶级期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF=81.2，Nature子刊）上发表突破性成果，首次揭示经典代谢酶ACAT1全新核内功能：在免疫刺激下，ACAT1可发生S60位点磷酸化并从线粒体转位至细胞核，在核内直接乙酰化NF-κB亚基p50的K146位点，削弱其DNA结合及转录抑制功能，进而促进NK细胞募集与活化，最终抑制结直肠癌生长。该研究建立了“肿瘤代谢—蛋白修饰—先天免疫—肿瘤进展”之间的新联系，为理解CRC免疫微环境及探索新的免疫治疗策略提供了重要依据。 赛索飞生物为本研究定制构建ACAT1、p50位点突变载体，提供高品质基因合成服务，有力支撑多层次精细遗传机制解析。
多组学锁定核心分子：
ACAT1与NK细胞抗肿瘤作用相关 研究团队首先根据CRC患者的多组学数据和生存数据，对可能影响肿瘤浸润NK细胞的代谢蛋白进行了系统筛选，ACAT1脱颖而出。进一步研究发现，在CRC患者中，ACAT1表达与肿瘤浸润NK细胞水平呈正相关，ACAT1高表达患者NK细胞浸润度越高，总体生存期则会显著延长。 为了验证这一关联是否具有功能意义，研究人员在CT26结直肠癌细胞中先敲除ACAT1，再恢复ACAT1表达。结果显示，恢复ACAT1能够明显抑制免疫完整小鼠中的肿瘤生长，而在免疫缺陷小鼠中这一抑制作用消失。进一步实验发现，ACAT1主要增加的是肿瘤组织中的NK细胞及细胞毒性NK细胞，而非CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或B细胞。 随后，研究人员对肿瘤浸润NK细胞进行了Smart-seq2分析，发现ACAT1还能够增强IFNG、RAC1、RAC2等与NK细胞杀伤功能相关的基因表达，同时降低部分抑制性受体表达。通过NK细胞耗竭实验进一步证明，ACAT1的抗肿瘤作用完全依赖NK细胞。 图1. ACAT1促进细胞毒性NK细胞浸润并抑制CRC生长。 ACAT1恢复表达后，肿瘤组织中NK细胞及细胞毒性NK细胞明显增加，并伴随NK细胞浸润增强；进一步的NK细胞耗竭实验表明，ACAT1介导的肿瘤抑制作用依赖NK细胞。
颠覆性新发现：
真正发挥抗肿瘤作用的“核内ACAT1” 在传统认知中，ACAT1主要定位于线粒体，是参与乙酰辅酶A代谢的重要酶。然而，研究人员发现，ACAT1不仅存在于线粒体，也定位于细胞核，并且CRC肿瘤组织中的核ACAT1水平远低于邻近组织，其水平与NK细胞浸润呈正相关。 为了进一步明确ACAT1不同于亚细胞定位的功能，研究者构建了具有核定位信号（NLS）、核输出信号（NES）以及线粒体靶向序列缺失（ΔMTS）的ACAT1构建体。 实验结果显示，促进ACAT1进入细胞核能够显著抑制肿瘤生长，并增加肿瘤组织中的NK细胞及细胞毒性NK细胞；相反，当ACAT1被阻止进入细胞核时，其抗肿瘤作用明显减弱。即使不同构建体中的线粒体ACAT1水平相近，NLS与NES组仍表现出明显不同的肿瘤抑制能力。随后，研究人员进行了更深入的研究，发现核内ACAT1的抗肿瘤功能依赖其酶活性，催化位点C126发生突变后，其促进NK细胞浸润和抑制肿瘤的作用随之消失。 图2. 核内定位决定ACAT1的抗肿瘤免疫功能。 在MC38原位结直肠癌模型中，与WT相比，核定位型ACAT1（NLS）显著抑制肿瘤生长并增加肿瘤浸润NK细胞及IFN-γ⁺、GzmB⁺细胞毒性NK细胞，而核输出型ACAT1（NES）则削弱这一效应。 这一结果揭示了ACAT1一个重要的“功能转换”：它并非仅通过经典线粒体代谢发挥作用，而是通过改变亚细胞定位，在细胞核中承担新的蛋白乙酰化调控功能。
分子机制拆解：
核ACAT1直接乙酰化p50 K146位点 明确核内ACAT1的关键作用后，研究团队进一步寻找其下游分子靶点。通过免疫共沉淀结合质谱分析核内ACAT1的互作蛋白，他们发现NF-κB家族成员NFKB1是核内ACAT1的重要结合蛋白。进一步实验证实，ACAT1能够在细胞核内直接与成熟的p50结合，GST pull-down实验也验证了二者的直接相互作用。 随后，研究人员发现，ACAT1能够促进p50乙酰化，当ACAT1催化活性受到破坏后，p50乙酰化水平则随之下降。体外乙酰化实验进一步证明，纯化的ACAT1能够在乙酰辅酶A存在的条件下直接乙酰化p50。 研究人员通过质谱分析，将关键位点进一步锁定在K146和K147。他们分别构建不可乙酰化的K146R和K147R突变体，实验结果显示，只有K146R能够明显阻断ACAT1介导的p50乙酰化；纯化蛋白体外实验也证实，p50 K146R无法被ACAT1有效乙酰化。至此，研究确认：核内ACAT1直接乙酰化p50的K146位点。 值得一提的是，本研究围绕ACAT1亚细胞定位、催化活性及关键磷酸化位点，以及NFKB1/p50关键氨基酸位点，开展了一系列严谨的遗传学验证。Supplementary Table11中的实验材料信息显示，本研究构建了包含多种ACAT1、p50位点突变体在内的系列重组DNA载体，部分突变质粒由赛索飞生物定制提供，为研究团队完成多层次精细分子机制验证提供了关键实验材料支撑。 图3. 核内ACAT1直接乙酰化p50 K146。 GST pull-down验证ACAT1与p50的直接结合；体外乙酰化实验显示ACAT1可直接促进p50乙酰化；K146R而非K147R突变能够阻断ACAT1介导的p50乙酰化；纯化蛋白实验进一步验证ACAT1直接作用于p50 K146。
上游磷酸化开关：
ACAT1 S60磷酸化驱动整套免疫轴 明确p50 K146是核内ACAT1的关键乙酰化位点后，研究进一步探究这一修饰如何与ACAT1上游的磷酸化状态及NK细胞抗肿瘤功能相关联。 结果显示，ACAT1 S60位点的磷酸化状态会直接影响p50乙酰化水平。与WT相比，模拟高磷酸化状态的ACAT1 S60E能够明显提高p50乙酰化水平，而S60A则会降低。同时，DNA pull-down实验表明，S60E能够降低DNA结合状态的p50，而S60A以及催化失活的C126A则会增加DNA结合的p50，说明ACAT1 pS60通过其乙酰转移酶活性削弱p50与DNA的结合。 进一步检测发现，ACAT1 S60E能够促进HLA-C、ICAM3、ULBP1、ULBP2和IL17D等与NK细胞活化相关分子的表达，同时提升CCL5、CXCL10和CXCL11等趋化因子的表达。ELISA实验证实，ACAT1高磷酸化模拟状态能增加CCL5、CXCL10和CXCL11的分泌，而S58A则削弱这一效应。在动物模型中，ACAT1 S58D（小鼠对应人ACAT1 S60E）能抑制肿瘤生长并增加肿瘤浸润的细胞毒性NK细胞。 更重要的是，研究团队开展了关键的因果验证：在NFKB1缺失并恢复p50 WT的小鼠肿瘤模型中，ACAT1 S58D能明显抑制肿瘤生长并增加细胞毒性NK细胞；而当p50的关键乙酰化位点K144（对应人p50 K146）突变为K144R后，ACAT1 S58D的肿瘤抑制作用和NK细胞增加效应均消失。这一结果直接证明，ACAT1 pS60的抗肿瘤免疫作用完全依赖于p50 K146乙酰化。 图4. ACAT1 pS60通过p50 K146乙酰化促进NK细胞抗肿瘤作用。 ACAT1 S60磷酸化模拟突变可通过p50 K146乙酰化抑制肿瘤生长并增加细胞毒性NK细胞，而p50 K146R突变能够削弱这一抗肿瘤效应，进一步证明p50 K146乙酰化是ACAT1介导NK细胞抗肿瘤作用的关键环节。
上游通路溯源：
IL-18调控ACAT1核转位完整通路 在明确核内ACAT1的作用后，研究团队进一步追溯了ACAT1核转位的上游调控机制。 他们发现，IL-12和IL-18等具有抗肿瘤作用的细胞因子能够增加核内ACAT1，其中IL-18作用尤为突出；相反，葡萄糖或血清缺乏等营养不足条件会显著降低核ACAT1水平。进一步研究表明，ACAT1的S60位点磷酸化是其核转位的重要开关。IL-18能够促进ACAT1 S60磷酸化，而S60A突变则无法响应IL-18并进入细胞核；模拟高磷酸化状态的S60E能够增加核内ACAT1水平。 通过机制研究进一步发现，蛋白磷酸酶PPM1A能够与ACAT1结合并促使其去磷酸化，而IL-18刺激可削弱这一作用；与此同时，S60磷酸化增强了ACAT1与importin α3的结合，从而促进其进入细胞核。由此，一条完整的调控链条浮现出来：IL-18 → ACAT1 S60磷酸化 → 核转位 → p50 K146乙酰化 → NK细胞募集与活化。
从分子机制走向临床意义：
ACAT1 pS60与患者预后相关 最后，研究团队分析了该机制在临床样本中的实际意义。研究人员利用CRC患者肿瘤组织进行免疫荧光和免疫组化分析发现，ACAT1 pS60水平与核内ACAT1水平及NK细胞浸润呈明显正相关，而与PPM1A水平呈负相关。更重要的是，较高的ACAT1 pS60水平与患者更长的总体生存期显著相关，提示它可能成为一个有潜力的预后标志物。 这些结果将分子机制与临床观察紧密联系起来：在肿瘤微环境中，免疫细胞产生的IL-18等信号可能促进ACAT1 S60磷酸化及核转位，增强NK细胞的抗肿瘤免疫；而肿瘤组织中的营养匮乏则可能降低ACAT1 pS60水平，限制其核转位，形成有利于肿瘤免疫逃逸的微环境。研究团队还指出，PPM1A可能是调控ACAT1 pS60的重要上游因子，但未来仍需发掘更多参与该过程的调控分子。
研究总结与创新亮点
本研究首次揭示了ACAT1在结直肠癌中的一种全新功能模式：ACAT1这一经典代谢酶并非只在线粒体中参与代谢，而是能够响应肿瘤微环境中的免疫和营养信号，通过S60磷酸化发生核转位，并在细胞核内直接乙酰化p50 K146，削弱p50的DNA结合及转录抑制作用，促进免疫相关因子和趋化因子表达，从而增强细胞毒性NK细胞的募集与活化，最终抑制结直肠癌进展。 值得关注的是，ACAT1 pS60与核内ACAT1、NK细胞浸润以及患者生存均具有明确关联，提示这一分子轴不仅具有重要的基础研究价值，也可能成为未来评估肿瘤免疫状态的潜在生物标志物。研究团队进一步提出，具有较高核ACAT1和ACAT1 pS60水平的CRC患者，未来可能更受益于NK细胞相关的免疫治疗。当然，这一方向仍需更多临床研究加以验证。但本研究从“肿瘤代谢”跨界到“先天免疫”的新视角，无疑为理解结直肠癌的免疫微环境、寻找新的免疫调控靶点以及探索NK细胞治疗策略，开辟了新的思路。